绪论
生物分离的基本概念
生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。
生物分离过程的主要特点
n 常无固定操作方法可循
生物材料组成非常复杂
n 分离操作步骤多，不易获得高收率
培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高
n 分离进程必须保护化合物的生理活性
生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏
n 基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物分离的一般工艺流程
发酵液→预处理→细胞分离→（ 细胞破碎→细胞碎片分离 ）
↙
→初步纯化→高度纯化→成品加工
注：（1）胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。
（2）在初步纯化及其以前的各步操作，处理的体积较大，着重于浓缩，称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作，着重于纯化，称为精制（或纯化）。
生物分离的各阶段的常用方法
（1）发酵液的预处理
n 加热
n 调pH
n 絮凝和凝聚
（2 ）固液分离
n 沉降
n 离心分离
n 过滤
n 错流过滤
（3）细胞破碎
n 机械法
高压匀浆、高速珠磨、
超声波破碎
n 非机械法
化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法
（4 ）初步纯化
n 沉淀法
n 吸附法
n 萃取法
n 超滤法
（5）高度纯化
n 层析
亲和层析、凝胶层析、离子交换层析
n 电泳
n 结晶和重结晶
（6 ）成品加工
n 无菌过滤
n 去热原
n 干燥
冷冻干燥、喷雾干燥
n 制剂
生物分离方法的选择依据
n 传统生物药物（抗生素）
根据具体条件，通过小实验决定，选择时应考虑两个因素。
（1）抗生素的理化性质：极性、酸碱性、溶解度等，了解其理化性质，通常利用纸层析和纸电泳的方法。
（2）抗生素的稳定性：要了解它在什么样的pH和温度范围易受破坏。
纸层析
抗生素在某一种溶剂中的Rf值大，表明它在该种溶剂中溶解度大；相反，如Rf值小，则溶解度小。如Rf为零，则说明不能溶解。如抗生素在极性强的溶剂中有较大的Rf值，则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中Rf值较大，在极性溶剂中Rf值较小。
纸电泳
通过纸层析判断为水溶性的抗生素，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。
电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表1-1。
生物分离方法的选择依据
n 基因工程药物
应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异，如，生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等。当几种方法联用时，最好以不同的分离机理为基础，且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液。
作业
n 胞内产物和胞外产物的分离纯化流程有何不同之处？
n 哪些方法比较适合生物物质的初步纯化？哪些方法比较适合生物物质的高度纯化？
n 以抗生素为例说明，选择生物分离方法时主要要考虑哪些因素？
第十章 预处理及固液分离
第一节 发酵液（培养液）的预处理
预处理的目的
® 改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。
® 去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。
预处理的方法
一、加热
加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。
预处理的方法
二、凝聚和絮凝
凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液），改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。
1．凝聚
凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）3•18H2O（明矾）、AlCl3•6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。
2．絮凝
絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。
影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液pH，搅拌速度和时间等。
三、使用惰性助滤剂
工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂
助滤剂的使用方法有两种：①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。
常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂（硅藻土或珍珠岩与石棉）、纤维素和活性炭。
助滤剂的选择要点如下：
（1）粒度选择
（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种
（3）用量选择
四、去除杂蛋白质的其它方法
1．等电点沉淀
蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。
2．变性沉淀
使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋ 、Cu2＋ 、Pb2＋ 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。
3．吸附
在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。
预处理的方法
五、不溶性多糖的去除
当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。
预处理的方法
六、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，预处理中应将它们除去。
® 去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。
® 镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。
® 除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀：
作业：
® 改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？
® 除去发酵液杂蛋白的常用方法有哪些？
第二节 细胞破碎
一、概念
破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。
二、影响细胞破碎的因素
1、细胞壁的结构
2、破碎方法
细胞壁的结构
® 细菌
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成 ，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8－10nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。
® 霉菌
霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm。
® 酵母菌
酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。
破碎方法
® 机械法
高压匀浆法
高速珠磨法
超声波破碎法
® 非机械法
化学法
酶解法
物理法：渗透压冲击法、冻融法
干燥法
1、非机械法
A、高压匀浆法
适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。
B、高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。
C、超声波破碎法：实验室常用
影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。
2、非机械法
A、化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分
B、酶解法
利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）
® 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用
® 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶
® 自溶的方法：
加热法、干燥法
C、渗透压冲击法
先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。
D、冻结-融化法
将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。
E、干燥法
经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。
方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥
三、破碎率的评价
细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：
Y(%)=[(N0-N)/N0]×100
N0－原始细胞数量
N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量
目前N0和N主要通过下面的方法获得 ：
® 直接计数法
在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。
® 间接计数法
间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。
四、各种破碎方法的评述
® 高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。
® 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.
五、破碎方法的选择依据
®处理量
高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产
®产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置
生化物质的稳定性
®细胞的数量和细胞壁的强度
®破碎程度
®提取分离的难易
总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。
第三节 固液分离
® 固液分离：是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。
一、固液分离设备
® 过滤设备
板框压滤机
真空鼓式过滤机
® 离心设备
过滤式离心机
沉降式离心机
1、过滤设备
® 板框过滤机
原理
特点 板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）。
适用对象 广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤 。
2、离心设备
® 过滤式离心机
转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。
® 沉降式离心机
转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于固体量较低（小于10％）的场合。常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。
二、过滤方式
® 常规过滤
料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直。
® 错流过滤
料液流向平行于过滤介质。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。
三、影响固液分离的因素
® 微生物种类
真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。
® 发酵液黏度
固液分离速度与黏度成反比
® 其它因素
发酵液的PH值、温度和加热时间
四、固液分离的发展动向
改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
® 利用错流过滤
® 利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
® 采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。
第十一章 萃取技术
第一节 溶剂萃取
一、基本概念
¨ 溶剂萃取：广义上指用溶剂将物质从固体或另一种互不相溶的溶剂中提取出来的方法。前者称为液－固萃取（浸取），后者称为液－液萃取。狭义的溶剂萃取是指液－液萃取。
¨ 料液：溶剂萃取中，被提取的溶液。F
¨ 溶质：欲提取的物质.
¨ 萃取剂：用以进行萃取的溶剂。S
¨ 萃取：料液中的溶质向萃取剂转移的过程。
¨ 萃取液：萃取平衡后，含有溶质的萃取剂溶液。
¨ 萃余液：被萃取出溶质以后的料液。R
¨ 分配系数：在一定温度、一定压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后，在两相中的浓度之比为一常数，这个常数称为分配系数。
¨ 萃取率：萃取相中溶质总量占原始料液中溶质总量的百分比。用于表示一种萃取剂对某种溶质的萃取能力。。
¨ 分离因素：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。
分离因素愈大（或愈小），说明两种溶质分离效果愈好，分离因素等于1，这两种溶质就分不开了。
二、萃取剂
¨ 常用萃取剂：
甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、甲苯、石油醚（按亲脂性递增）
¨ 萃取剂选择的原则：
1）对所需成分溶解度大，其它成分溶解度小。根据相似相溶原理进行选择。
2）萃取剂与料液的互溶度愈小愈好
3）毒性小。低毒性（乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯）、中等毒性（甲苯、甲醇）、强毒性（苯、氯仿）
4）经济、安全、腐蚀性低、沸点不高、挥发性小、便于回收
三、工业萃取的步骤和分类
四、乳化和破乳化
¨ 乳化：发酵液经预处理和过滤后，虽能除去大部分非水溶性的杂质和部分水溶性杂质，但残留的杂质（如蛋白质等）具有表面活性，在进行溶剂萃取时，有机相和水相难以分层。
¨ 破乳方法
1）加入表面活性剂：1231、PPB、亚油酸钠
2）加入电解质：如氯化钠、硫酸铵
3）吸附法：通过多孔性介质
4）高压电破乳：
5）加热
6）稀释法：加入连续相
五、影响萃取的主要因素
¨ 乳化作用
¨ pH值：影响弱酸或弱碱药物的分配系数和药物的稳定性。
¨ 温度和时间：药物的稳定性、分配系数
¨ 盐析作用：盐析剂与水分子结合，游离水分子减少，药物在水相中溶解度降低，易转入有机相；降低有机溶剂在水中的溶解度；萃余相比重增大，利于分相
¨ 溶剂的种类和用量及萃取方式
总结：
溶剂萃取法比离子交换法选择性好、比沉淀法分离程度高、比蒸馏法能耗低，便于连续操作，现已广泛用于抗生素、有机酸、维生素、激素等产物的提取上，但是普通的有机溶剂萃取法由于以下原因难于应用于蛋白质分离（1 ）许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；（2 ）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
作业：
¨ 总结多级错流萃取和多级逆流萃取的异同。
¨ 名词解释：萃取剂、萃取液、萃余液、分配系数、分离因素、乳化
¨ 溶剂萃取包括哪些步骤？
¨ 常用的萃取剂有哪些？如何进行选择？
第二节 双水相萃取
一、概述
¨ 概念
双水相萃取是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
¨ 双水相的构成
1、两种高聚物水溶液相互混合可产生双水相系统。
2、高聚物水溶液与低分子量化合物水溶液也可形成双水相系统。
¨ 双水相萃取的特点
1）含水量高（70％～90％），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质且不易引起蛋白质的变性失活。
2）不存在有机溶剂残留问题。
3）易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。这是其他分离技术无法比拟的。
二、相图
双水相的形成条件和定量关系常用相图表示。P80是PEG/Dex体系的相图。图中的曲线称为双节线，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。
双水相系统的相图可由实验来确定。
三、影响双水相萃取的因素
¨ 聚合物的影响
在PEG/Dex体系中，PEG分子量的减少，会使蛋白质在两相中的分配系数增大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含PEG相中聚集而转向另一相。
¨ 体系中无机盐离子的影响
盐对带电大分子的分配影响很大。如DNA萃取时，离子组分的微小变化可以使DNA从一相几乎从一相完全转移到了另一相。生物大分子的分配主要决定于离子的种类和各种离子之间的比例。在体系中加入适当的盐可大大促进带相反电荷的蛋白质的分离。
¨ 体系pH的影响
pH微小的变化有时会使蛋白质的分配系数改变2～3个数量级。
¨ 体系温度的影响
温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的生物活性。
¨ 细胞浓度的影响
通常细胞浓度的增加，会降低细胞破碎后内含物的分配系数。
四、双水相萃取的应用
双水相萃取目前较多应用于胞内酶的提取和精制上。用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。
用双水相萃取胞内酶，PEG/盐系统应用的较广泛。通常将目的蛋白质分配在上相（PEG），而细胞碎片分配在下相（盐），便于离心分离。
五、双水相提取胞内酶的具体操作：
1.萃取：适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。
2.上下相的分离：在萃取达到平衡后，就必须使上下相分离。有两种方法：重力沉降和离心分离。
3.多聚物的分离：当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中，相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。见P92图6－12和图6－11
第三节 超临界流体萃取
一、基本概念和原理
¨ 超临界流体萃取技术（简称SFE）：是利用超临界流体作为萃取剂的一种高效萃取技术。
¨ 临界点：物质气液不分（既有气体的性质,又有液体的性质）的状态点。物质具有固有的临界点,此状态点的温度Tc、压力Pc称为临界温度和临界压力。当气体物质处于它的临界温度和压力以上,无论施加多大的压力,也不可能使其液化。
¨ 超临界流体(简称SCF)：处于临界温度和压力以上的流体。
¨ 超临界流体的特性：
1.既有气体的性质（易于扩散和运动，黏度小，因此传质速率高，短时间间内就能达到萃取平衡）,又有液体的性质（密度大，溶解度大） 。
2.溶解能力随密度的增大而增大，而密度与压力和温度直接相关，因此压力和温度的变化会大大改变其溶解能力。超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因其密度下降溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。
¨ 超临界CO2流体的特性
1.超临界温度（ Tc=31.06度)是所有溶剂中最接近室温的。因此操作可在接近室温的情况下进行。
2.超临界压力（Pc＝7.39 MPa）也适中。
3.临界密度是常用超临界溶剂中最高的。因此溶解能力强。
4.无毒、惰性、无残留、价廉。
所以超临界CO2流体是应用最广泛的超临界萃取溶剂。
二、超临界萃取的过程和典型流程
¨ 超临界流体萃取的过程
由萃取阶段和分离阶段组合而成的。
在萃取阶段,超临界流体将所需组分从原料中提取出来。由萃取釜和加压装置组成。
在分离阶段,通过变化温度或压力等参数,或其他方法,使萃取组分从超临界流体中分离出来,并使萃取剂循环使用。由分离釜和减压装置组成。
¨ 三种典型流程
1.等温法：是通过变化压力使萃取组分从超临界流体中分离出来。
含有溶质的超临界流体经过膨胀阀后压力下降,对溶质的溶解度下降。溶质析出由分离釜底部取出,充当萃取剂的气体则经压缩机送回萃取釜循环使用。
2.等压法：是利用温度的变化来实现溶质与萃取剂的分离。
含萃取质的超临界流体经加热升温使萃取剂与溶质分离,由分离釜下方取出溶质。作为萃取剂的气体经降温升压后送回萃取釜使用。
3.吸附法 ：是采用可吸附溶质而不吸附超临界流体的吸附剂使萃取物分离。
三、超临界萃取过程的影响因素
¨ 压力
当温度恒定时,提高压力可增大超临界流体的密度,从而提高超临界流体的溶解能力和萃取容量。
¨ 温度
当萃取压力较高时,温度的提高可以增大溶质扩散系数。但温度提高也会降低超临界流体密度从而减小其萃取容量,温度过高还会使热敏性物质产生降解。
¨ 流体密度
溶剂的溶解能力与其密度有关,密度大,溶解能力大, 但密度大时,传质系数小。
¨ 溶剂比
当萃取温度和压力确定后,溶剂比是一个重要参数。在低溶剂比时,经一定时间萃取后固体中残留量大。用非常高的溶剂比时,萃取后固体中的残留趋于低限。溶剂比的大小必须考虑经济性。
¨ 颗粒度
一般情况下,萃取速率随固体物料颗粒尺寸减少而增加。
作业
1.超临界CO2流体为什么会是应用最广泛的超临界萃取剂？
2.综述超临界萃取在生物和食品工业的应用。
3.简述超临界流体萃取技术的原理。
4.结合课本P92图6－12，简述双水相萃取提取胞内酶的具体操作。
第十二章 固相析出技术
基本概念
l 固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。
l 结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法。
l 沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。
第一节 盐析法
一、盐析法的原理及特点
l 盐析法的原理
1）中性盐离子中和蛋白质表面电荷。
2）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜。
l 盐析法的特点
经济、安全、操作简便、不需特殊设备、应用范围广泛、不易引起蛋白质变性 ，但盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯阶段，需和其它方法交替使用。
二、盐析常用的盐
常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。
硫酸铵具有盐析作用强，溶解度大且受温度影响小，一般不会使蛋白质变性，价廉易得，分段分离效果较好等优点，所以大多数情况下都采用硫酸铵进行盐析。但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。
三、影响盐析的因素
l 盐饱和度的影响 不同的蛋白质，其结构和性质不同，盐析时所需的饱和度也就不同。
l 蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。
l PH的影响 进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pI附近。
l 温度的影响 在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：
（1）加硫酸铵的饱和溶液。
为达到一定的饱和度，所需加入的饱和硫酸铵溶液的体积可由下式求得
S2 － S1
V= V0
1 － S2
式中V－加入的饱和硫酸铵溶液的体积，L；
V0—溶液的原始体积，L；
S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％。
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
（2）直接加固体硫酸铵。
为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸铵的量，可由表查得，或由下式计算而得
X=
式中 S1及S2—初始和最终溶液的饱和度，％；
X—1L溶液所需加入得固体硫酸铵的克数；
G—经验常数，0℃时为515；20℃为513；
A—常数，0℃时为0.27；20℃为0.29。
第二节 有机溶剂沉淀法
一、有机溶剂沉淀法的原理和特点
l 原理
1）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数降低 。2）破坏蛋白质表面的水膜。
l 特点 分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点低，易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易。但有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在低温下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较高，有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。
二、常用的有机溶剂
常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点。
三、有机溶剂的用量计算
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液达到一定的溶剂浓度，需加入有机溶剂的量可参考表或按下面的公式计算：
S2 － S1
V= V0
1 － S2
式中，V—需加入的有机溶剂的体积；
V0—原溶液体积；
S1—原溶液中有机溶剂的浓度；
S2—需达到的有机溶剂的浓度；
四、有机溶剂沉淀法的影响因素
l 温度
有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用。另外，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。
l pH值
pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。
四、有机溶剂沉淀法的影响因素
l 样品浓度
样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。
l 中性盐浓度
较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。
四、有机溶剂沉淀法的影响因素
l 某些金属离子
一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。
作业：
1.盐析法为何能用于分离蛋白质混合物？盐析法一般用于生物分离的哪个阶段？
2.有一20mL的料液，要采用直接加固体硫酸铵的方式进行盐析，其硫酸铵饱和度为20％，需要达到的硫酸铵饱和度为40％，问需加入多少固体硫酸铵？操作时应注意哪些问题？
3．有机溶剂沉淀法在操作时应注意哪些事项？
4．某一30mL料液中乙醇浓度为35％，要将乙醇浓度调整到55％，需往料液中加入多少mL的无水乙醇？
第三节 其他沉淀法
一、等电点沉淀法
等电点沉淀法只适用在等电点时溶解度很低的两性生化物质，如酪蛋白。
很少单独使用等电点沉淀法。往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀法一起使用。
在实际工作中普遍用等电点沉淀法作为去杂手段 。
二、水溶性非离子型聚合物沉淀法
l 常用的非离子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖 ，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 PEG浓度常为20％ 。
l 优点 ：室温条件下操作；沉淀的颗粒往往比较大；不容易破坏蛋白质活性 。
l 缺点：所得的沉淀中含有大量的PEG。
三、成盐沉淀法
1）金属离子沉淀法 ：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀 。常用的金属离子Zn2+ 、Ca2+ 、Pb2＋
2）有机酸沉淀法
3）无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出
特点：常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。
四、选择性变性沉淀法
l 利用表面活性剂或有机溶剂引起变性。
l 利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，而保留另一些组分。
l 选择性的酸碱变性。
第四节 结晶法
自学提纲：
l 结晶与沉淀的区别
l 结晶过程为什么具有很好的选择性？
l 结晶的过程
l 过饱和溶液制备主要有哪些方法？
l 哪些因素可促使晶核形成？
l 如何提高晶体的质量？
自学指导
l 结晶与沉淀的区别
沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程。两者的区别在于构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同，前者有规则，后者无规则。在条件变化缓慢时，溶质分子具有足够时间进行排列，有利于结晶形成；相反，当条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不及排列就析出，结果形成无定形沉淀。
自学指导
l 结晶过程为什么具有很好的选择性？
由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶法具有高度的选择性。
l 结晶的过程
结晶包括以下三个过程：过饱和溶液的形成、晶核的形成、晶体的生长。
自学指导
l 过饱和溶液制备主要有哪些方法？
1.饱和溶液冷却
2.部分溶剂蒸发：
蒸发法是使溶液在加压、常压或减压下加热，蒸发除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。
3.化学反应结晶法
此法是通过加入反应剂或调节pH值生成一个新的溶解度更低的物质，当其浓度超过它的溶解度时，就有结晶析出。
4.解析法：
此法是向溶液中加入某些物质，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶析出。
自学指导
l 哪些因素可促使晶核形成？
真正自动成核的机会很少，均靠外来因素如机械震动、摩擦器壁、搅拌、添加晶种促使晶核形成。
l 如何提高晶体的质量？
主要从晶体的大小、形状和纯度等三个方面进行，具体见课本P257—262。
作业
l 使用等电点沉淀法、成盐沉淀法和选择性变性沉淀法各应注意什么问题？
l PEG沉淀效果的影响因素有哪些？如何去除蛋白沉淀中的PEG？
第十三章 吸附分离技术
一、吸附分离技术概论
1．吸附：是指物质从气体或液体浓缩到固体表面从而达到分离的过程。
2.吸附的机理
3.吸附的分类
物理吸附
l 分子间力(范德华力)引起
l 没有选择性
l 吸附速度快、解吸容易
化学吸附
l 化学反应，形成牢固的化学键
l 有选择性
l 吸附慢、不易解吸
4.吸附分离技术的特点
n 操作简便、设备简单、价廉、安全；
n 常用于从大体积料液（稀溶液）中提取含量较少的目的物；
n 不用或少用有机溶剂，吸附和洗脱过程中pH变化小，较少引起生物活性物质的变性失活；
n 选择性较差，收率低（人工合成的大孔网状聚合物吸附剂性能有很大改进）。
5.吸附分离技术的应用方式
n 如果需要的组分较易（或较牢固地）被吸附，可在吸附后除去不吸附或较不易吸附的杂质，然后再将样品洗脱；
二、吸附剂
1．传统吸附剂
（1）活性炭
n 活化：使用前应加热烘干，以除去大部分气体。对于一般的活性炭可在160℃加热干燥4～5小时；锦纶活性炭受热易变形，可于100℃干燥4～5小时。
（2）硅胶
n 适用对象：
可用于萜类、固醇类、生物碱、酸性化合物、磷脂类、脂肪类、氨基酸类等的吸附分离。
n 活化：
硅胶一般于105～110℃加热干燥1～2小时后使用。活化后的硅胶应马上使用，如当时不用，则要贮存在干燥器或密闭的瓶中，但时间不宜过长。
（3）氧化铝
n 适用对象：特别适用于亲脂性成分的分离，广泛应用在醇、酚、生物碱、染料、苷类、氨基酸、蛋白质以及维生素、抗生素等物质的分离。
n 种类：
n 活化：在使用前150℃下加热干燥2小时，除去水分以使其活化。
2.大孔吸附树脂
大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是在离子交换剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型吸附剂，是依靠它和被吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作的。在实际应用中对一些与其骨架结构相近的分子具很强的吸附能力。
（1）大孔吸附树脂的特点
n 选择性好，解吸容易，机械强度好，可反复使用和流体阻力小；
n 其孔隙大小、骨架结构和极性，可按照需要，选择不同的原料和合成条件而改变，因此可适用于各种有机化合物；
n 使用时无需考虑盐类的存在。
（2）大孔吸附树脂的类型
n 非极性大孔吸附树脂
XAD-1¡« XAD-5
n 中等极性大孔吸附树脂
XAD-6¡« XAD-7
n 极性大孔吸附树脂
XAD-9～ XAD-12和XE
（3）大孔吸附树脂的选择
n 吸附物的极性
非极性吸附剂易吸附非极性物质（从极性溶剂如水中）；极性吸附剂易吸附极性物质（从非极性溶剂中）；中等极性的吸附剂则对上述两种情况都具有吸附能力
三、影响吸附的因素
1.吸附剂的性质
（1）比表面积：与吸附容量有关
（2）孔径：与吸附速度有关
（3）极性大小：与吸附力的强弱有关
表面具含氧官能团如－COOH、－OH等，有助于对极性分子的吸附。
2.吸附质的性质
（1）溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少。所以极性物质适宜在非极性溶剂中被吸附，非极性物质适宜在极性溶剂中被吸附。
3.操作条件的影响
作业
1.常用的吸附剂有哪些？使用前如何活化？
2.如何选用活性炭？
3.大孔吸附树脂和传统的吸附剂比有何优越性？
4.选择大孔吸附树脂应考虑哪些因素？
第十四章 离子交换分离技术
一、 离子交换树脂的概念和结构
能与其他物质进行离子交换的物质；
常用的离子交换剂有离子交换树脂和多糖基离子交换剂。
聚苯乙烯型离子交换树脂结构：
Ú骨架
Ú活性基团
Ú可交换离子
当树脂处在溶液中时，活性离子可在树脂的骨架中进进出出，与溶液中的同性离子发生交换过程。交换推动力为两种离子的浓度差异。
离子交换现象可用下面的方程式表示：
R-X+ + Y+ R-Y+ + X+
式中R-表示功能基团和载体，X+为活性离子，Y+为溶液中的同性离子。
如果树脂的活性离子带正电荷，则可和溶液中的阳离子发生交换，称为阳离子交换树脂。
如果树脂的活性离子带负电荷，则可和溶液中的阴离子发生交换，称为阴离子交换树脂。
二、离子交换分离技术的分离原理
用离子交换法分离纯化物质主要通过选择性吸附和分步洗脱实现的。
（1）X+为活性离子，YH+及Z+为待分离离子；
（2）YH+和Z+取代X+而被吸附；
（3）加碱后YH+失去正电荷，被洗脱；
（4）提高X+的浓度取代出Z+
三、离子交换树脂的分类
（一）按活性基团分类
1.强酸性阳离子交换树脂
含有强酸性基团，常见的有磺酸基(-SO3H)，易在溶液中解离H+，电离反应如下 ：
R-SO3H = R-SO3-+ H+
SO3-基团能吸附溶液中的其它阳离子，如：
R-SO3- +Na+=R-SO3Na
由于强酸性树脂的解离能力很强，因此在很宽的PH范围内都能保持良好的离子交换能力，使用时的pH没有限制，在PH1~14范围内均可使用。用强酸进行再生处理。
2．弱酸性阳离子交换树脂
含弱酸性活性基团-COOH（羧基）, -OH（酚羟基），能在水中离解出H+ ，但解离受pH值限制，在低pH下难以解离。
R-COOH R-COO- + H+
R-COOH 应在pH7以上的溶液中操作。
R-OH 应在pH 9以上的溶液中操作。
弱酸性阳离子交换树脂可吸附溶液中的阳离子，进行如下离子交换反应：
R-COOH＋Na+ R-COONa＋H+
用强酸进行再生处理，但耗酸量较少。
3．强碱性阴离子交换树脂
常见的活性基团有-NR3OH（季铵基团 ）能在水中解离出-OH- 而呈碱性，离解性很强，基本不受PH值影响。反应简式为：
R-NR3OH = R-NR3+ +OH-
强碱性阴离子树脂能吸附溶液中的其它阴离子如Cl-，离子交换反应式如下：
R-NR3OH＋Cl- R-NR3 Cl- ＋OH-
使用的pH没有限制，再生一般用强碱进行
4．弱碱性阴离子交换树脂
常见的活性基团有伯胺基（-NH2），仲胺基（-NHR），叔胺基（-NR2），它们在水中能解离出OH-，但解离能力较弱，在碱性环境中的解离度受到抑制. 解离反应如下:
R -NH2 • H2O R-NH3+ + OH-
可吸附溶液中的阴离子。
只能在 PH<7的溶液中使用。 用NaOH再生时耗碱量较少，还可用Na2CO3等再生。
（二）按理化性质分类
1. 凝胶型树脂
外 观：一般是透明的
空隙特征：吸水后形成微细的空隙，失水后，孔隙消失。
吸附性能：适用于吸附交换无机离子等小离子
2. 大孔型树脂
外 观：一般是不透明的
空隙特征：孔径大，为永久性孔隙，可在非水溶涨下使用。
吸附性能：善于吸附大分子有机物
四、离子交换树脂的命名
离子交换树脂的命名法规定离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成。第一位数字代表产品的分类，第二位数字代表骨架，第三位数字为顺序号。分类代号和骨架代号都分成7种，分别以0～6七个数字表示，其含义见书P104表7－3。
在凝胶型树脂编号后加“×”连接阿拉伯数字表示交联度。对大孔型离子交换树脂，须在型号前加字母“D”。
在国内的树脂商品中命名并不规范。有一些命名方式一直沿用至今，如：732（强酸001×7树脂）、724（弱酸101×7树脂）、717（强碱201×7树脂）。
五、离子交换树脂的理化性能
1．交联度
离子交换树脂的骨架是由各种有机原料聚合而成的网状结构，例如强酸性阳离子交换树脂的合成过程，是先由苯乙烯聚合而成为长的链状分子，再由二乙烯苯把各链状分子联成立体型的网状体。这里二乙烯苯称为交联剂。
在树脂原料总重量中交联剂所占百分比称为交联度。如二乙烯苯在原料总量中占10%。则称该树脂的交联度为10％。
Ú 树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到限制。另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强度高。但是如果交联度过大交换反应的速度慢，因此要求树脂的交联度一般为4-14％。在不影响分离时，也以选高交联度的树脂为宜。
2. 交换容量
离子交换树脂交换能力的大小，可用交换容量表示。
交换容量是每克干燥的离子交换树脂或每毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数 。
一般选用交换容量大的树脂，可用较少的树脂交换较多的化合物 。
交换容量可通过实验测定。
六、离子交换分离技术的操作
（一）树脂和操作条件的选择
1. 树脂选择
1）对阴阳离子交换树脂的选择
被分离物质带正电荷，应采用阳离子交换树脂；被分离物质带负电荷，应采用阴离子交换树脂。
2）对离子交换树脂强弱的选择
强碱性离子宜用弱酸性树脂， 弱碱性离子宜用强酸性树脂；弱酸性离子宜用强碱性树脂，强酸性离子宜用弱碱性树脂
3）对树脂理化性能的选择
如吸附大分子离子选择交联度较低的树脂。
2. 操作条件
1）交换时pH
产物稳定，产物离子化，树脂解离
2）树脂的型式
阳树脂可用氢型或钠型
阴树脂可用羟型或氯型
3）溶液中产物浓度：
低价离子增加浓度有利于交换上树脂，高价离子宜在稀释时被吸附。
4）洗脱条件
和吸附条件相反
（二）操作方式
1. 静态操作
是将树脂与交换溶液混合置一定的容器中搅拌进行 。
2. 动态操作（柱式操作）
交换、洗脱、再生均在柱中进行
（三）离子交换树脂的工作过程
1. 预处理和转型
1）用水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒（倾泻或浮选法）。
2）用8～10倍量的1mol/L盐酸或NaOH交替浸泡（或搅拌）一次。每次换酸碱前都要用水洗至中性。
3）在使用时，常用酸、碱或NaCl将树脂转变为一定的离子形式，称为转型。
阳树脂处理成氢型按酸－碱－酸顺序处理；处理成钠型按碱－酸－碱 （或NaCl）顺序。
阴树脂处理成羟型按碱－酸－碱顺序处理；处理成氯型按酸－碱－酸（或NaCl）顺序处理。
2.装柱
装柱时，先在交换柱的下端铺上一层玻璃丝（或棉花），灌入少量水（或缓冲溶液），然后倾入带水（或缓冲溶液）的树脂。
装柱时应防止树脂层中存留气泡，以免交换时试液与树脂无法充分接触。树脂高度一般约为柱高的90%。为防止加试液时树脂被冲起，在柱的上端亦应铺一层玻璃纤维。装柱时还应注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生气泡，而使交换不完全。
交换柱也可以用滴定管代替。
3. 交换吸附
将样品加到交换柱上，用活塞控制一定的流速进行交换，完成离子吸附。
4. 洗脱
当交换完毕之后，用适当的洗脱液（改变pH值或含高浓度同性离子）进行洗脱。
随着洗脱的进行，洗出液离子浓度逐渐增大，达到最大值之后又逐渐减小，至完全洗脱之后，被洗出之离子浓度又等于零。
5. 树脂的再生
再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。
再生时，大量水冲洗 用转型的方法处理 。
七、多糖基离子交换剂
（一）特点
1.亲水性强
2.孔径较大
3.电荷密度适当
4.粒度较小
（二）种类
1.离子交换纤维素：实验室中最常用的为DEAE-纤维素（强碱型）， CM-纤维素（弱酸型），前者适用于中性和酸性蛋白质的分离，后者适用于中性和碱性蛋白质分离。
2.离子交换葡聚糖： Sephadex 离子交换剂。离子交换葡聚糖命名时将活性基团写在前面，然后写骨架Sephadex，最后写编号。在编号前添一字母“C”表示阳离子或“A”表示阴离子。如CM－Sephadex C－25、DEAE－Sephadex A－25等。
3.离子交换琼脂糖：Sepharose离子交换剂
八、离子交换分离技术的应用 －－纯水的制备
天然水中常含一些无机盐类，为了除去这些无机盐类以便将水净化，可将水通过氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种阳离子。如以Ca2+代表水中的阳离子，则交换反应为：
2R-SO3H+Ca2+＝(R-SO3)2Ca+2H+
再通过氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各种阴离子。如以C1-代表水中的阴离子，则交换反应为：
RN(CH3)3OH+C1-＝RN(CH3)3Cl+OH-
交换下来的H+和OH-结合成H2O，这样就可以得到相当纯净的所谓“去离子水”，可以代替蒸馏水使用。
作业
1.离子交换树脂由哪几部分构成？
2.根据离子交换树脂的活性基团不同，树脂可分为哪四大类？各类的主要特征如何？
3.大孔离子交换树脂和普通凝胶树脂的外观、孔结构和吸附性能有何不同？
4.101×7和D152树脂各代表什么树脂？
5.如何选择离子交换树脂？
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大专理科教案 -> 生物分离原理与技术